VetBact
VetBact logotyp

VetBact

Sveriges lantbruksuniversitet

Veterinärmedicinsk bakteriologi: information om betydelsefulla arter
Veterinärmedicinsk bakteriologi


Biokemiska tester

Innehåll
Blandad syra-fermentering
Citrattest
Divätesulfid-produktion
DNastest
Hippurattest
Indol-test
Kaliumhydroxidtest
Katalas-test
Koagulas-test
Lecithinastest
Oxidas-test
Ureastest
Voges-Proskauer- (VP-) test

Blandad syra-fermentering

Allmänt

En del bakterier kan fermentera (jäsa) glukos till en blandning av följande organiska syror: myrsyra, ättiksyra och mjölksyra. Detta kallas blandad syra-jäsning och orsakar kraftigt sänkt pH i mediet. Därför kan blandad syrajäsning påvisas genom tillsats av indikatorn metylrött (MR). Testet kallas ibland för MR-test.

Metodik

MR-test

Metylrött-test, där det högra röret visar en positiv reaktion. (Bild: SLU/SVA.)

  1. Slamma upp en bakteriekoloni från en renkultur i MR/VP-medium.
  2. Inkubera vid 30°C under 3 dygn eller 37°C under 48 tim.
  3. Tillsätt 2-3 droppar av en metylrött-lösning.
  • Positivt testresultat: rött färgomslag
  • Negativt testresultat: inget färgomslag.

Användning

Vissa medlemmar av familjen Enterobacteriaceae har blandad syrajäsning (se resp. bakteriesida), som alltså kan användas för att skilja på dessa bakterier.

Uppdaterad: 2017-12-08.

Innehåll

Citrattest

Citrattest

Figuren visar resultatet av ett citrattest genom stickinokulering på "Simmons citratrör" där rör A utgör negativ controll. Rör B innehåller Citrobacter freundii och rör C innehåller Escherichia coli. Observera att ett färgomslag har skett i rör B eftersom C. freundii kan växa på citrat som kolkälla.

Bild: Karl-Erik Johansson (BVF, SLU) och Lise-Lotte Fernström (BVF, SLU).
 

Allmänt

En del bakterier kan utnyttja citrat som enda kolkälla och citrattestet visar om bakterien ifråga kan göra det.

Metodik

  1. Inokulera ett citrat-buljongrör med en liten mängd bakterier.  Man kan också stryka ut eller stickinokulera på "Simmons citratrör".
  2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.
  • Positivt testresultat: växt i citrat-buljong eller växt med blått färgomslag i Simmons citratrör.
  • Negativt testresultat: ingen växt i citrat-buljong eller växt men utan färgomslag (d.v.s. fortfarande grön färg) i Simmons citratrör.

Användning

Citrat-testet används bl.a. för att skilja Citrobacter freundii från Escherichia coli.

 

Uppdaterad: 2018-06-06.

Innehåll

Divätesulfid-produktion

Allmänt

En del bakterier kan metabolisera vissa svavelföreningar under bildning av divätesulfid (H2S, äldre namn: svavelväte). Divätesulfid är en giftig och illaluktande gas (luktar ruttna ägg). Om man använder lättlösliga järn- eller blysalter (t.ex. järncitrat) i ett s.k. H2S-medium, som också innehåller natriumtiosulfat (Na2S2O3), kan dessa reagera med eventuell H2S under bildning av svart olöslig järn- resp. blysulfid.

Metodik

  1. Stickinokulera H2S-mediet med bakterier från en koloni.
  2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.
  • Positivt testresultat: svärtning av mediet.
  • Negativt testresultat: oförändrat medium.

Användning

Kan bl.a. användas för differentiering av vissa Campylobacter-arter.


Uppdaterad: 2012-12-11.

Innehåll

DNastest

Allmänt

Många bakterier har enzymer, som bryter ner nukleinsyra för att bakterien ska kunna använda de ingående nukleotiderna till att bygga upp den egna nukleinsyran. DNas är ett sådant enzym som alltså bryter ner DNA. Förekomst av DNas är karakteristiskt för vissa arter eller stammar av bakterier och används alltså för typning.

Metodik

DNastest

Figure: DNas-test på Staphylococcus spp. Stammen i det övre stryket är negativ (ingen uppklarning runt stryket), medan stammen i det nedre stryket är positiv. (Bild: SLU/SVA)

Man kan testa om bakterien har DNas genom att odla dem på en agarplatta, som innehåller DNA. Om bakterien har DNas och om man låter bakterierna växa över natten så kommer DNA att brytas ner och om man då häller utspädd saltsyra (HCl) på plattan, så får man en klar zon närmast kolonierna eller stryket och en utfällning på resten av plattan. Detta beror på att de enskilda nukleotiderna är lösliga i utspädd HCl, medan DNA faller ut.

Användning

Testet är användbart för att skilja:
 

  • Serratia spp. från Enterobacter spp.
  • Staphylococcus aureus (de flesta stammar är koagulaspositiva) från koagulasnegativa Staphylococcus spp.
  • Moraxella catarrhalis från Neisseria spp.

 

Uppdaterad: 2017-12-08.

Innehåll

Hippurattest

Hippurattest

Figuren visar resultatet av ett hippurattest där rör A utgör negativ kontroll. Rör B innehåller Streptococcus agalactiae, som är hippuratpositiv och rör C innehåller Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae, som är hippuratnegativ. Observera att ett färgomslag har skett i rör B därför att S. agalactiae är hippuratpositiv. Notera även att hippuratnegativa bakterier kan ge ett svagt färgomslag.

Bild: Karl-Erik Johansson (BVF, SLU) och Lise-Lotte Fernström (BVF, SLU).

Allmänt

 

Vissa bakterier kan hydrolysera hippurat till aminosyran glycin och benzoat med hjälp av enzymet hippurikas. Glycin kan påvisas med hjälp av ninhydrin, som reagerar med fria aminogrupper (-NH2) och det bildas en blåfärgad produkt.

Metodik

  1. Slamma upp en plast- eller platinaögla med bakterier (t.ex. Campylobacter sp.) i 0,5 ml natriumhippuratlösning.
  2. Inkubera suspensionen vid 37ºC under 2 tim i vattenbad.
  3. Tillsätt därefter försiktigt 0,2 ml ninhydrinlösning utan omblandning.
  4. Inkubera röret under ytterligare 10 min vid 37ºC före avläsning.
  • Positivt testresultat: Djupt mörkblå färg.
  • Negativt testresultat: Blekblå färg.

Användning

Hippurat-testet används framför allt för att skilja Campylobacter jejuni  (hip+) från Campylobacter coli (hip-) och för att skilja på olika streptokocker (se figur). Används också i kombination med andra tester för att typa Brachyspira spp.

 

Uppdaterad: 2017-03-31.

Innehåll

Indol-test

 

Allmänt

Indol-test

Spot indol-test.
A. Applicering av spot indolreagens.
B. Applicering av indol-positiv bakterie.
C. Applicering av indol-negativ bakterie.
Klicka på bilden för att förstora den.

Bakterier som uttrycker enzymet tryptofanas kan hydrolysera aminosyran tryptofan till indol, pyrodruvsyra och ammoniak. Närvaro av indol kan påvisas antingen med hjälp av Kovács reagens eller med spot indol-testet. Spot indol testet innehåller p-Dimethylaminocinnamaldehyd vilket ger en turkos färgning. Kovács reagens innehåller p-dimetylamino-benzylaldehyd, som bildar ett rödfärgat komplex med indol.

 

Metodik, spot indol

  1. Applicera ett par droppar av indolreagenset på ett filtrerpapper.
  2. Fyll en plastögla med bakteriematerial (odlade 24-48 tim).
  3. Gnugga öglan med bakterier mot indolreagenset på filtrerpappret.
  • Positivt testresultat: Blått färgomslag inom 10 sek.
  • Negativt testresultat: Inget färgomslag.

 

 

 

Metodik, Kovács reagens

Indol-test

Indol-test med Kovács reagens. Det högra röret visar ett positivt resultat. (Bild: SLU/SVA.)

  1. Slamma upp en koloni från en renkultur av den bakterie, som ska undersökas, i lämplig buljong (t.ex. LTLSB- eller tryptofanbuljong).
  2. Inkubera buljongen vid 37°C i 20-28 tim.
  3. Tillsätt några droppar av Kovács reagens.
  • Positivt testresultat: Indolreagenset får cerisröd färg.
  • Negativt testresultat: Indolreagenset förblir svagt gult.

Användning

Konfirmering av misstänkta E. coli-stammar. Typning (artbestämning) av Brachyspira-arter i kombination med andra tester. Kovács indolreagens är något känsligare än spot idolreagensert, men det är inte att rekomendera för anaeroba bakterierer. Spot indol kan användas får såväl anaeroba som aeroba bakterier.

 

Uppdaterad: 2017-12-20.

Innehåll

Kaliumhydroxidtest

Kaliumhydroxidtest

Kaliumhydroxidtest.
A. Applicering av kaliumhydroxidlösning på objektglas.
B. Bakterier överförs och blandas med KOH-lösningen.
C. Resultat med gramnegativa bakterier där vätskan blir viskös och man kan se DNA-tråden.
D. Resultat med grampositiva bakterier där vätskan inte blir viskös.
Klicka på bilden för att förstora den.

Allmänt

Syftet med kaliumhydroxidtestet (KOH testet) är att identifiera gramnegativa bakterier. KOH löser upp det tunna peptidoglykanlagret i cellväggen hos gramnegativa bakterier, men påverkar inte cellväggen hos grampositiva bakterier. Lyseringen av cellväggen hos gramnegativa bakterier innebär att innehållet inklusive DNA frigörs. Frisläppt DNA gör lösningen viskös, fastnar på plastöglan och blir tråddragande. Cellväggen hos grampositiva bakterier påverkas inte av KOH, då de har ett tjockare peptidoglykanlager. Detta medför att cellen inte lyserar och inget DNA frigörs och lösningen blir inte viskös.

Material

  • Objektglas
  • Plastögla
  • 3% KOH

Metod

  • Applicera en droppe 3% KOH på objektglaset
  • Överför en välfylld ögla med bakteriematerial (odlade 24-48 tim) till objektglaset med KOH
  • Blanda väl
  • Gramnegativa bakterier blir viskösa och tråddragande inom 30 sek
  • Använd positiva och negativa kontroller

Positivt resultat: Lösningen med bakterier (gramnegativa) blir viskös

Negativt resultat: Lösningen med bakterier (grampositiva) blir inte viskös

Användning

Syftet med KOH testet är att snabbt skilja mellan gramnegativa och grampositiva bakterier som ett komplement till Gramfärgning. Testet är inte användbart för anaeroba bakterier.

Uppdaterad: 2017-12-20.

Innehåll

Katalas-test

Katalas-test

Katalastest
A. Applicera en droppe 3% väteperoxid på ett objektglas.
B. Överför bakterier med hjälp av en plastögla till H2O2 -lösningen.
C. En katalas positiv bakterie ger gasbildning (O2) i form av bubblor
D. En katalas negaitiv bakterie ger ingen gasbildning. Notera att det finns fragment av bakteriekolonier, men inga bubblor i lösningen.
- Klicka på bilden för att förstora den.

Allmän information

Många aeroba bakterier och de flesta som är fakultativt anaeroba producerar enzymet katalas, som ingår i bakteriernas enzymsystem för avgiftning av H2O2 (väteperoxid). H2O2 bildas från superoxidradikalen med hjälp av enzymet superoxiddismutas. Många syretoleranta bakterier har peroxidas (som inte är samma enzym som cytokrom c oxidas) i stället för katalas. Obligata anaerober saknar både superoxiddismutas och katalas.

Katalas innehåller en hemgrupp vid den aktiva ytan och följande reaktion katalyseras med ett mycket högt omsättningstal (turnover number):

2 H2O2 → 2 H2O + O2

Metodik

  1. Sprid bakterier på en agarplatta och inkubera den över natten (18-24 tim) vid lämpliga betingelser.
  2. Applicera en droppe 3% H2O2 på ett objektglas. Var försiktig med H2O2 som är frätande !!!Samla upp bakterier från en koloni, med en plast- eller platinaögla och applicera dem på ett objektglas.
  3. Om bakterierna tas från en blodplatta måste man undvika att få med agar, eftersom hemoglobinet också innehåller hemgrupper, som kan ge upphov till en falskt positv reaktion.
  • Positivt testresultat: Gasbildning (O2) i form av bubblor visar att bakterien har katalas.
  • Negativt testresultat: Ingen gasbildning.

Användning

Katalastestet används huvudsakligen för grampositiva bakterier och kan t.ex. utnyttjas för att skilja Staphylococcus spp. och Micrococcus spp., som är katalaspositiva från Streptococcus spp. respektive Enterococcus spp. som är katalasnegativa.

Uppdaterad: 2017-12-20.

Innehåll

Koagulas-test

Allmänt

Vissa bakterier producerar koagulas, som är ett enzym, som kan ovandla fibrinogen till fibrin, d.v.s. koagulera plasma. Förmågan att producera koagulas anses bl.a. vara kopplat till stafylokockers virulens. Testet används alltså för att skilja på koagulas-positiva och koagulas-negativa stafylokocker.

Metodik

  1. Slamma upp en bakteriekoloni från den misstänkta renkulturen i 0,5 ml plasma från häst, kanin eller människa.
  2. Inkubera vid 37ºC.
  3. Avläs efter 4 timmar. Vid negativ reaktion (se nedan) fortsätt inkuberingen.
  4. Slutavläs efter totalt ett dygn.
  • Positiv reaktion om plasman koagulerar och koaglet är stabilt, d.v.s. löses inte upp igen efter omskakning.
  • Negativ reaktion om plasman inte koagulerar eller koaglet löses upp efter omskakning.
Koagulastest
Koagulas-test av Stahylococcus spp. Det övre röret visar ett positivt resultat (plasman har koagulerat) och det undre ett negativt.

Användning

Används för att skilja Staphylococcus aureus från koagulasnegativa Staphylococcus spp. Observera dock att vissa stammar av S. aureus kan vara koagulasnegativa, men det är ovanligt. Vissa stammar av S. hyicus och S. intermedius kan vara koagulaspositva. S. pseudintermedius är koagulaspositiv, men först efter 24 tim.

Uppdaterad: 2013-10-01.

Innehåll

Lecithinastest

Allmänt

Många bakterier har enzymer som kan bryta ner lipider, s.k. lipaser. Lecithinas, som även kallas fosfolipas C, är ett sådant enzym som spjälkar fosfolipiden lecithin (= t.ex. fosfatidylkolin). Fosfolipider, som är laddade är vanligen lösliga i vatten, men en av produkterna som bildas vid spjälkningen, nämligen en diglycerid,  är oladdad och har två långa kolvätekedjor. Den är därför olöslig i vatten och detta utnyttjas i lecithinas-testet då man odlar bakterierna på äggule-agar. Äggula innehåller mycket lecithin.

Metodik

  1. Stryk ut bakterierna i form av ett streck på äggule-agar.
  2. Läs av plattan efter 24 tim.
  • Positivt testresultat: Utfällning runt utstryket av bakterier.
  • Negativt testresultat: Ingen utfällning.

Lecithinastest
Figure: Bacillus cereus på äggule-agar. Notera utfällningen runt bakteriestryket, som visar att den är positiv för lecithinas.

Användning

Kan bl.a. användas för att skilja på vissa arter inom genus Bacillus.

 

Uppdaterad: 2017-11-30.

Innehåll

Oxidas-test

Oxidas-test

Oxidastest
A. Ett par droppar av oxidasreagenset appliceras på ett filtrerpapper.
B och C. Kolonimaterial överförs med hjälp av en plastögla till fläcken med reagenset på filtrerpappret.
C. Fläcken till vänster består av oxidaspositiva bakterier och den till höger av oxidasnegativa bakterier.
D. Slutresultat kan observeras efter 30 sek.
- Klicka på bilden för att förstora den.

Allmän information

Bakterier, som har aerob cellandning, har ofta cytokrom c och ett cytokrom c oxidas, vilket i kombination med andra metoder kan användas vid typning. Man använder ofta ett kommersiellt test, vilket innehåller en artificiell elektronacceptor (N, N, N', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin, se Fig. 1), som ändrar färg beroende på redoxtillstånd. Substansen är en s.k. redoxindikator och den kan alltså oxideras av den oxiderade formen av cytokrom c. Cytokrom c oxidas är det sista enzymet i andningskedjan, där det normalt reducerar syre till vatten och pumpar ut protoner enligt följande nettoreaktion:

4 Fe2+-cytochrome cred + 8H+in + O24 Fe3+-cytochrome cox + 2H2O + 4H+out
 
Cytokrom c oxidas är ett transmembranproteinkomplex (Komplex IV), som också finns i mitokondriernas plasma- (inner-) membran.

Metodik

  1. Håll plastampullen (som innehåller en glasampull) rättvänd med tippen vänd ifrån dig och krossa glasampullen, som ligger inuti plastampullen, mellan tummen och pekfingret.
  2. Applicera ett par droppar av oxidasreagenset på ett filtrerpapper.
  3. Överför bakterier från en koloni med hjälp av en plast- eller platinaögla till fläcken med reagenset på filtrerpappret. Kolonikulturen ska ha inkuberats vid lämplig temperatur under 18-24 tim.
  • Positivt testresultat: Mörkt blålila färgomslag inom 10-30 sek.
  • Negativt testresultat: Inget färgomslag eller färgomslag efter mer än 30 sek.

Notera att oxidasreagenset inte är stabilt efter det att ampullen har öppnats. Det kan användas under någon timmes tid, men det oxideras så småningom av syret i luften.

Användning

Oxidas-testet används ofta för identifiering av gram-negativa bakterier. T.ex. för att identifiera medlemmar av familjen Enterobacteriaceae, som är oxidas-negativa, utom genus Plesiomonas (ox+). Medlemmar av familjen Pseudomonadaceae, samt genus Aeromonas och Campylobacter är oxidas-positiva.

 

Uppdaterad: 2017-12-20.

Innehåll

Ureastest

Ureastest

Figuren visar resultatet av ett ureastest, där rör A utgör negativ kontroll. Rör B innehåller, Proteus sp. och rör C innehåller Escherichia coli. Observera att ett pH-omslag har skett i rör B därför att Proteus spp. är ureaspositiva.

Bild: Karl-Erik Johansson (BVF, SLU) och Lise-Lotte Fernström (BVF, SLU).

 

Allmänt

Vissa bakterier har enzymet ureas, som i närvaro av H2O bryter ner urea (=urinämne eller karbamid) till NH3 (ammoniak) och CO2 (kol­di­oxid), som bildar ammonium­karbonat i närvaro av vatten. Se kemisk reaktionsformel.
Ureastest

Metodik

Man kan testa om bakterien har ureas genom att odla dem i ureas-medium, som innehåller en pH-indikator. Om bakterien har ureas bildas ammoniumkarbonat och odlingsmediet blir basisk d.v.s. färgen slår om till röd (cerise) färg.

Ureas-buljong:

Substans Mängd (g)
Pepton 1,0
Glukos 1,0
Natriumklorid 5,0
Dinatriumfosfat 1,2
Kaliumdivätefosfat 0,8
Fenolrött 0,004

Användning

Ureastestet kan bl.a. användas för att skilja E. coli, som är ureasnegativ, från Proteus spp., som är ureaspositiv.

Uppdaterad: 2017-03-31.

Innehåll

Voges-Proskauer- (VP-) test

Allmänt

VP-testet visar om bakterien har butandiol-fermentation och kan spjälka glukos till acetoin via pyruvat och därefter till 2,3-butandiol enligt:

2 pyruvate + NADH --> 2CO2 + 2,3-butanediol.

Om KOH (kaliumhydroxid) tillsättes, så omvandlas  acetoin till diacetyl (= 2,3-butandion), som reagerar med alfa-naftol och bildar ett rosa komplex.

Metodik

  1. Slamma upp en bakteriekoloni från den renkultur, som ska undersökas, i VP/MR-buljong.
  2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.
  3. Tillsätt 0,2 ml 40% KOH och därefter 0,6 ml alfa-naftollösning.
  • Positivt testresultat: rosa färgomslag.
  • Negativt testresultat: inget färgomslag.
Voges-Proskauer-test
Voges-Proskauer-test, där det högra röret visar ett positivt testresultat. (Bild: SLU/SVA.)

Användning

Klebsiella spp. och Enterobacter spp. har butandiolfermentation till skillnad från Escherichia coli, Salmonella spp. och Shigella spp.

Uppdaterad: 2012-12-11.

Innehåll

Senast uppdaterade

Nybloggat


Sveriges lantbruksuniversitet